သတင်း

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်အသုံးပြုနေသောဘရောက်ဆာဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှုအကန့်အသတ်ရှိသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ဤအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို တင်ဆက်ပါမည်။
ကင်ဆာဆဲလ်များသည် ဆဲလ်များ၏စိတ်ဖိစီးမှုကို ကျော်လွှားပြီး ဆက်လက်တိုးတက်ရန် အမျိုးမျိုးသော ယန္တရားများကို တီထွင်ခဲ့ကြသည်။ပရိုတင်း kinase R (PKR) နှင့် ၎င်း၏ ပရိုတင်း လှုံ့ဆော်ပေးသူ (PACT) တို့သည် ဆဲလ်များ ပြန့်ပွားမှုနှင့် apoptosis ကို ဟန့်တားသည့် အမျိုးမျိုးသော စိတ်ဖိစီးမှု အချက်ပြမှုများကို စောင့်ကြည့်သည့် ကနဦး တုံ့ပြန်သူများ ဖြစ်သည်။သို့သော်လည်း ကင်ဆာဆဲလ်များရှိ PACT-PKR လမ်းကြောင်း၏ စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းကို အများစု မသိရှိကြသေးပါ။ဤတွင်၊ ရှည်လျားသော coding မဟုတ်သော RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) သည် PACT-PKR လမ်းကြောင်းကို ဟန့်တားကာ ကင်ဆာဆဲလ်များ ပြန့်ပွားမှုကို မြှင့်တင်ရာတွင် တိုက်ရိုက်ပါဝင်နေကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။CRISPRi 971 ကင်ဆာနှင့်ဆက်စပ်သော lncRNA ၏ ကြီးမားသောလုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ စစ်ဆေးခြင်းကို အသုံးပြု၍ DARS-AS1 သည် ကင်ဆာဆဲလ်များ ပြန့်ပွားမှုနှင့် သိသိသာသာ ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ထို့ကြောင့်၊ DARS-AS1 သည် ဆဲလ်များပေါက်ပွားမှုကို ဟန့်တားကာ ကင်ဆာဆဲလ်များ ဆဲလ်များအတွင်းပိုင်းရှိ ကင်ဆာဆဲလ်များ ပျံ့နှံ့မှုကို မြှင့်တင်ပေးပြီး vivo တွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ လျှော့ချပေးသည်။စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအားဖြင့်၊ DARS-AS1 သည် PACT activation domain နှင့် တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်ပြီး PACT-PKR အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို ဟန့်တားကာ၊ ထို့ကြောင့် PKR activation၊ eIF2α phosphorylation နှင့် apoptotic ဆဲလ်သေခြင်းကို တားဆီးပေးသည်။ဆေးခန်းအရ၊ DARS-AS1 သည် ကင်ဆာအများအပြားတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ဖော်ပြနေပြီး၊ ဤ lncRNA ကို အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းသည် ညံ့ဖျင်းသောခန့်မှန်းချက်ကို ညွှန်ပြနေသည်။ဤလေ့လာမှုသည် DARS-AS1 lncRNA မှ PACT-PKR လမ်းကြောင်း၏ ကင်ဆာရောဂါဆိုင်ရာ သီးသန့်စည်းမျဉ်းကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြပြီး ကင်ဆာရောဂါကြိုတင်ခန့်မှန်းမှုနှင့် ကုသမှုအတွက် နောက်ထပ်ပစ်မှတ်တစ်ခုကို ထောက်ပံ့ပေးသည်။
စိတ်ဖိစီးမှုနှင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ထိန်းကျောင်းနိုင်မှုသည် ကင်ဆာဆဲလ်များ ရှင်သန်ကြီးထွားမှုနှင့် ကြီးထွားမှု၏ အရေးကြီးသော လက္ခဏာတစ်ရပ်ဖြစ်သည်။ပြင်းထန်သော သေးငယ်သောပတ်ဝန်းကျင်များတွင် ကင်ဆာ၏ လျင်မြန်စွာ ပြန့်ပွားမှုနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ လက္ခဏာများ—အာဟာရချို့တဲ့မှု၊ hypoxia နှင့် pH နိမ့်သည်—ဆဲလ်သေအချက်ပြမှုလမ်းကြောင်းများကို အစပြုစေသည့်—ထိုအရာက ဆဲလ်သေအချက်ပြမှုလမ်းကြောင်းများကို ဖြစ်စေသည်။p535၊ အပူရှော့ခ်ပရိုတိန်း 6၊ 7၊ KRAS8၊ 9 နှင့် HIF-110၊ 11၊ 12၊ 13 ကဲ့သို့သော ဖိစီးမှုခံစားနိုင်သော ဗီဇများ၏ ကမောက်ကမဖြစ်မှုကို မကြာခဏတွေ့ရှိရပြီး apoptosis ကို ပိတ်ဆို့ကာ ရှင်သန်မှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်။
ပရိုတိန်း kinase R (PKR) သည် အရေးကြီးသော ဖိစီးမှုအာရုံခံကိရိယာနှင့် eukaryotic အစပျိုးမှုအချက် 2α (eIF2α) ၏ ဆဲလ်အသေများကို ဆဲလ်သေခြင်းသို့ ချိတ်ဆက်ပေးသည့် ဘာသာပြန်စနစ်ထိန်းညှိပေးသည့် eukaryotic kinase ၏ subunit kinase ဖြစ်သည်။PKR ကို နိုင်ငံခြားမှ ကြိုးနှစ်ထပ် သောင်တင် RNA (dsRNA) မှ ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းဖြင့် မူလက ဗိုင်းရပ်စ်ပိုး ပရိုတင်းတစ်မျိုးအဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။အသက်သွင်းပြီးနောက်၊ PKR phosphorylates သည် eIF2α ကို ဗိုင်းရပ်စ်နှင့် ဆဲလ်လူလာပရိုတိန်းပေါင်းစပ်မှုကို ဟန့်တားရန် 14,15,16။PACT (PKR activator ပရိုတိန်း) ကို dsRNA17,18,19,20,21,22,23 မပါရှိဘဲ ပထမဆုံး PKR activator ပရိုတင်းအဖြစ် ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားပါသည်။PKR နှင့်တိုက်ရိုက်အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုအားဖြင့် PACT သည် အမျိုးမျိုးသောစိတ်ဖိစီးမှုများကို (သွေးရည်ကြည်ငတ်မွတ်ခြင်း၊ ပါအောက်ဆိုဒ် သို့မဟုတ် အာဆင်းနိုက်ကုသမှု) သည် PKR နှင့် ရေအောက်အချက်ပြလမ်းကြောင်းများသို့ ကူးပြောင်းပေးပါသည်။eIF2α phosphorylation အပြင်၊ PACT-mediated PKR activation သည် PI3K/Akt24 လမ်းကြောင်းမှတစ်ဆင့် ပြောင်းလဲထားသော redox အခြေအနေကို၊ p5325,26 နှင့် NF-κB27,28 Regulates transcription, 29 မှတစ်ဆင့် အဆင့်ဆင့်ပြောင်းလဲထားသော DNA ပျက်စီးမှုများအပါအဝင် စိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုနှင့်ဆက်စပ်သော အဖြစ်အပျက်များကို အစပျိုးပေးသည်။ စိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှု၊ ကြီးထွားမှု၊ apoptosis နှင့် အခြားသော အဓိကကျသောဆဲလ်ဖြစ်စဉ်များတွင် ၎င်းတို့၏ အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှ PKR နှင့် PACT တို့သည် ရောဂါများစွာအတွက် ကုသရေးပစ်မှတ်များ အထူးသဖြင့် ကင်ဆာ 30,31,32,33 တို့အတွက် အလားအလာကောင်းများရှိပါသည်။သို့သော်လည်း ဤ pleiotropic လုပ်ငန်းဆောင်တာနှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ အရေးပါမှုများရှိနေသော်လည်း၊ ကင်ဆာဆဲလ်များရှိ PACT/PKR လုပ်ဆောင်ချက်၏ စည်းမျဉ်းသည် ခက်ခဲနေသေးသည်။
lncRNAs များသည် ပရိုတင်းကုဒ်ရေးနိုင်သော အလားအလာမရှိသော နျူကလီးအိုရိုက် 200 ထက်ကြီးသော စာသားမှတ်တမ်းများဖြစ်သည်။နောက်ဆုံးပေါ် ဂျီနိုအာ စီစစ်ခြင်း ပရောဂျက်များသည် ထောင်ပေါင်းများစွာသော lncRNAs များကို ဖော်ထုတ်နိုင်သောကြောင့် ၎င်းတို့၏ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ငန်းဆောင်တာများကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြရန် 35,36 အားထုတ်မှုများစွာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ကြီးထွားလာနေသော သုတေသနအဖွဲ့တစ်ခုမှ LncRNA များသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ငန်းစဉ် ၃၇ ခုတွင် X-chromosome inactivation38,39၊ imprinting40၊ transcription41,42, translation43 နှင့် ကင်ဆာကြီးထွားမှု 44,45,46,47 အပါအဝင် ဇီဝကမ္မဖြစ်စဉ်များစွာတွင် ပါဝင်နေကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။LncRNA အများအပြားသည် PACT/PKR လမ်းကြောင်းတွင် ပါဝင်နေကြောင်း ဤလေ့လာမှုများက ဖော်ပြခဲ့သည်။ထိုလေ့လာမှုတစ်ခုအရ lncRNA ASPACT သည် PACT စာသားမှတ်တမ်းကို ဟန့်တားပြီး PACT mRNA ၏ နျူကလီးယား ထိန်းသိမ်းမှုကို တိုးမြင့်စေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။အခြားလေ့လာမှုများက lncRNA nc886 သည် PKR နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး ၎င်း၏ phosphorylation 49,50 ကို ဟန့်တားကြောင်းပြသခဲ့သည်။ယခုအချိန်အထိ၊ LncRNA သည် PACT-mediated PKR activation ကို ထိန်းညှိခြင်းမပြုရသေးပါ။
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ကို oncogenic lncRNA51,52,53,54 အဖြစ်သတ်မှတ်ထားသည်။miP-194-5p53၊ miP-12952 နှင့် miP-532-3p51 တို့၏စည်းမျဉ်းအားဖြင့် DARS-AS1 သည် ကြည်လင်သောဆဲလ်ကျောက်ကပ်ကင်ဆာ၊ သိုင်းရွိုက်ကင်ဆာနှင့် သေးငယ်သောဆဲလ်မဟုတ်သော အဆုတ်ကင်ဆာတို့၏ ကြီးထွားမှုကို မြှင့်တင်ရန် ပြသထားသည်။Tong နှင့် လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များက DARS-AS1 သည် ပရိုတင်း 39 (RBM39) RNA-binding motif ၏တည်ငြိမ်မှုကို ထိန်းသိမ်းထားခြင်းဖြင့် myeloma တိုးတက်မှုကို မြှင့်တင်ပေးကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။သို့သော်၊ ဤ lncRNA သည် PACT-PKR တက်ကြွမှုနှင့် ကင်ဆာဆဲလ်များ၏ ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းများတွင် ပါ၀င်မှုရှိမရှိအပေါ် လေ့လာမှုမပြုလုပ်ခဲ့ပါ။
ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် CRISPRi စနစ်ကို အသုံးပြု၍ ကြီးမားသောလုပ်ဆောင်ချက်ဆုံးရှုံးမှုမျက်နှာပြင်ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး DARS-AS1 lncRNA သည် ကင်ဆာဆဲလ်အမျိုးအစားများစွာ၏ ကြီးထွားမှုကို အားပေးသည်ဟု ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အဓိက ယန္တရားတစ်ခုကို ဖော်ထုတ်ထားသည်- DARS-AS1 သည် PACT နှင့် တိုက်ရိုက် ချိတ်ဆက်သည်၊ PACT နှင့် PKR binding ကို ဟန့်တားသည်၊ eIF2α ၏ phosphorylation ကို တားဆီးသည်၊ အောက်ပိုင်း PKR အလွှာကို တားဆီးကာ နောက်ဆုံးတွင် apoptotic cell သေဆုံးမှုကို ဟန့်တားသည်။နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အလုပ်သည် DARS-AS1 lncRNA ကို PACT-PKR လမ်းကြောင်း၏ ထိန်းညှိမှုတစ်ခုအနေနှင့် ကင်ဆာကုသမှုနှင့် ကြိုတင်ခန့်မှန်းချက်အတွက် အလားအလာရှိသော ပစ်မှတ်တစ်ခုအဖြစ် ဖော်ပြသည်။
ကျယ်ပြန့်သော မျိုးဗီဇဆိုင်ရာ ပရိုဖိုင်ပြုလုပ်ခြင်းဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများက ကင်ဆာနှင့် ဆက်စပ်နေသည့် LncRNAs ရာပေါင်းများစွာကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။သို့သော်လည်း ၎င်းတို့၏ လုပ်ဆောင်ချက်များကို အများစု မသိရှိနိုင်ပါ။56။ကင်ဆာရောဂါဖြစ်ပွားမှုတွင် ပါဝင်သော အလားအလာရှိသော lncRNA ကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် CRISPRi စနစ် (ပုံ 1a) ကို အသုံးပြု၍ SW620 အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်လိုင်းတွင် ကြီးထွားမှုလျှော့ချရန်အတွက် ဆုံးရှုံးမှု၏လုပ်ဆောင်ချက်မျက်နှာပြင်ကို ကျွန်ုပ်တို့လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။SW480 နှင့် SW620 အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်လိုင်းများ၏ထူးခြားသောအင်္ဂါရပ်မှာလူနာတစ်ဦးတည်းရှိမူလတန်းနှင့်ဒုတိယအကျိတ်များမှဆင်းသက်လာခြင်းဖြစ်သည်။၎င်းသည် အဆင့်မြင့် အူမကြီးကင်ဆာ၏ တိုးတက်မှုအတွက် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို လေ့လာရန်အတွက် အဖိုးတန်သော နှိုင်းယှဉ်မှုကို ပေးသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် RNA စီစစ်ခြင်းကို အသုံးပြု၍ အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်လိုင်းများ (SW480 နှင့် SW620) ၏ စာသားမှတ်တမ်းများကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာပြီး ထုတ်ဝေထားသော စာပေများမှ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော လုပ်ဆောင်နိုင်သော lncRNAs အချို့ကို စုဆောင်းခဲ့ပါသည်။ဤရလဒ်များအပေါ်အခြေခံ၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကင်ဆာ-ဆက်စပ်သော lncRNAs 971 နှင့် 500 ပစ်မှတ်မထားသော sgRNA oligos တို့ကို ပစ်မှတ်ထားသည့် 7355 sgRNA oligos ပါဝင်သော ပေါင်းစပ်ထားသော sgRNA စာကြည့်တိုက်ကို ဒီဇိုင်းရေးဆွဲခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲဒေတာ 1)။
CRISPRi စနစ်သုံးပြီး စိစစ်ခြင်း၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။b sgRNA ကြွယ်ဝမှုကို စစ်ဆေးပြီးနောက်။အလျားလိုက် အစက်ချမျဉ်းသည် log2 (ခေါက်ပြောင်းလဲမှု) = ±0.58 ကိုကိုယ်စားပြုသည်။ဒေါင်လိုက် အစက်ချမျဉ်းသည် p တန်ဖိုး = 0.05 ကိုဖော်ပြသည်။အနက်ရောင်အစက်များသည် ပစ်မှတ်မဟုတ်သော sgRNA (NC အဖြစ်သတ်မှတ်ထားသည်) ကိုကိုယ်စားပြုသည်။အနီစက်များသည် DARS-AS1 ကို ပစ်မှတ်ထားသည့် sgRNA များဖြစ်သည်။အပြာရောင်အစက်များသည် ယခင်က ဖော်ပြထားသော oncogenic lncRNA LINC00205 ကို ပစ်မှတ်ထားသည့် sgRNA များဖြစ်သည်။ခေါက်ပြောင်းလဲမှု = (ပုံမှန်ဖတ်ခြင်း၊ နေ့ 17)/(ပုံမှန်ဖတ်ခြင်း၊ နေ့ 0)။c DARS-AS1 sgRNA သည် ဆဲလ်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားသည်။အမှားဘားများသည် စမ်းသပ်ချက်သုံးခု၏ ±စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 two-tailed Student's t-test.d အကျိတ်ရှိ DARS-AS1 စကားရပ် (TCGA ဒေတာအတွဲ)။em BLCA၊ KIRC၊ PRAD၊ LUSC၊ UCEC၊ LUAD၊ LIHC၊ KIRP နှင့် COAD အသီးသီးရှိ လူနာများမှ တွဲထားသော ပုံမှန်နှင့် အကျိတ်နမူနာများတွင် DARS-AS1 ကို ဖော်ပြခြင်း (TCGA dataset)။p-values ​​များကို paired two-tailed Student's t-test ကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့သည်။
ပလတ်စမစ်ကိုတည်ဆောက်ပြီး lentivirus ကိုထုပ်ပိုးပြီးနောက်၊ သီးခြားကူးစက်မှုစမ်းသပ်မှုလေးခုတွင် dCas9-SW620 အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်လိုင်းကို ကျွန်ုပ်တို့သည် အထက်ပါစာကြည့်တိုက်ဖြင့် ပြောင်းလဲပေးခဲ့ပါသည်။ဤရောဂါပိုးများအတွက် ကူးစက်မှုများပြားခြင်း (MOI) သည် 0.1–0.3 ဖြစ်ပြီး၊ ဆဲလ်တစ်ခုစီကို sgRNA တစ်ခုဖြင့်သာ ကူးစက်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။in vitro ယဉ်ကျေးမှုကို 18 ရက်အကြာတွင်၊ ပစ်မှတ် sgRNAs များ၏ ကြွယ်ဝမှုပရိုဖိုင်ကို စစ်ဆေးပြီးနောက် လျော့နည်းသွားသည် သို့မဟုတ် တိုးလာကာ၊ ပစ်မှတ်မရှိသော ထိန်းချုပ်မှုဆိုင်ရာ oligonucleotides အရေအတွက်သည် အကြိုစစ်ဆေးမှုပရိုဖိုင်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မပြောင်းလဲသေးဘဲ၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပစ်မှတ်သည် အလွန်ထူးခြားသော စခရင်တွင် သီးသန့်ရှိကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ စာကြည့်တိုက်။ထမင်း။1b နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 1)။ အဆုတ်ကင်ဆာနှင့် အသည်းကင်ဆာ တိုးတက်မှု 58,59,60 ကို မြှင့်တင်ရန် ယခင်က အစီရင်ခံခဲ့သည့် LINC00205 သည် (log2 (foldchange) < −0.58, p value < 0.05)၊ ဤစစ်ဆေးမှု၏ ယုံကြည်စိတ်ချရမှု (ပုံ. 1b) ကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ အဆုတ်ကင်ဆာနှင့် အသည်းကင်ဆာ တိုးတက်မှု 58,59,60 ကို မြှင့်တင်ရန် ယခင်က အစီရင်ခံခဲ့သည့် LINC00205 သည် (log2 (foldchange) < −0.58, p value < 0.05)၊ ဤစစ်ဆေးမှု၏ ယုံကြည်စိတ်ချရမှု (ပုံ. 1b) ကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис ။၁ခ)။ အဆုတ်ကင်ဆာနှင့် အသည်းကင်ဆာ 58,59,60 တိုးတက်မှုကို မြှင့်တင်ရန် ယခင်က အစီရင်ခံထားသည့် LINC00205 ကို ဖယ်ထုတ်ထားသည် (log2 (ခေါက်ပြောင်းလဲမှု) <-0.58၊ p-value <0.05)၊ ဤစစ်ဆေးမှု၏ ကြံ့ခိုင်မှုကို အတည်ပြုခြင်း (ပုံ။ .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 变化）< 国 0.0.5 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 变化）< 国 0.0.5 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис ။၁ခ)။ အဆုတ်နှင့် အသည်းကင်ဆာ တိုးတက်မှု 58,59,60 ကို မြှင့်တင်ရန် ယခင်က အစီရင်ခံထားသော LINC00205 ကို ဖယ်ထုတ်ထားသည် (log2 (ခေါက်ပြောင်းလဲမှု) <-0.58၊ p-value <0.05)၊ ဤစစ်ဆေးမှု၏ ကြံ့ခိုင်မှုကို အတည်ပြုခြင်း (ပုံ။ .1b)။
စမ်းသပ်ထားသည့် lncRNAs အားလုံးတွင် DARS-AS1 ကို ယဉ်ကျေးမှု 18 ရက်အကြာတွင် သိသာထင်ရှားစွာ လျှော့ချခြင်းဖြင့် cognate sgRNA oligonucleotides သုံးခုကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေပြီး ဤ lncRNA ၏ ဆုတ်ယုတ်မှုသည် ကင်ဆာပြန့်ပွားမှုကို လျော့ကျစေသည် (ပုံ. 1b)။ဤရလဒ်ကို MTS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်များတွင် DARS-AS1 နှောင့်နှေးသည့်ဆဲလ်များ၏ ကြီးထွားနှုန်းသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (ပုံ 1c) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ထက်ဝက်မျှသာရှိပြီး အခြားကင်ဆာအမျိုးအစားများစွာ၏ ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့် ကိုက်ညီကြောင်း ပြသထားသည်။: ရှင်းလင်းသောဆဲလ်ကျောက်ကပ်ကင်ဆာ၊ သိုင်းရွိုက်ကင်ဆာနှင့် သေးငယ်သောဆဲလ်မဟုတ်သော အဆုတ်ကင်ဆာ၅၁၊၅၂၊၅၃၊၅၅။သို့သော် အူမကြီးကင်ဆာရှိ ၎င်း၏လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် မော်လီကျူးယန္တရားများကို မစူးစမ်းနိုင်ပါ။ထို့ကြောင့် ဆက်လက်လေ့လာရန် ဤ lncRNA ကို ရွေးချယ်ခဲ့ပါသည်။
လူနာများတွင် DARS-AS1 အသုံးအနှုန်းကိုလေ့လာရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Cancer Genome Atlas (TCGA) ပရောဂျက်မှ အကျိတ်နမူနာ 10,327 ကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ DARS-AS1 ကို အူမကြီး adenocarcinoma (COAD)၊ renal clear cell carcinoma (KIRC) နှင့် renal papillary cell carcinoma (KIRP) အပါအဝင် အကျိတ်အမျိုးမျိုးရှိ ကျန်းမာသောဆဲလ်များတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ဖော်ပြပြီး သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိပေးထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက ပြသပါသည်။.အလွန်နည်းပါသည် (ပုံ။ 1d နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 1a၊ b)။ တွဲထားသော ကျန်းမာသော/အကျိတ်နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (BLCA)၊ ကျောက်ကပ်ကျောက်ကပ်ဆိုင်ရာ ဆဲလ်ကင်ဆာ (KIRC)၊ ဆီးကျိတ် adenocarcinoma (PRAD)၊ အဆုတ်ဆဲလ်ကင်ဆာ (LUSC) ၏ ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (LUSC)၊ သားအိမ်တွင်းကင်ဆာ (UCEC)၊ အဆုတ် adenocarcinoma (LUAD)၊ အသည်းအသည်းဆဲလ်များ ကင်ဆာ (LIHC)၊ ကျောက်ကပ်ကျောက်ကပ်ဆိုင်ရာ ဆဲလ်ကင်ဆာ (KIRP) နှင့် အူမကြီး adenocarcinoma (COAD) (p တန်ဖိုး < 0.05) (ပုံ။ 1e–m) . တွဲထားသော ကျန်းမာသော/အကျိတ်နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (BLCA)၊ ကျောက်ကပ်ကျောက်ကပ်ဆိုင်ရာ ဆဲလ်ကင်ဆာ (KIRC)၊ ဆီးကျိတ် adenocarcinoma (PRAD)၊ အဆုတ်ဆဲလ်ကင်ဆာ (LUSC) ၏ ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (LUSC)၊ သားအိမ်တွင်းကင်ဆာ (UCEC)၊ အဆုတ် adenocarcinoma (LUAD)၊ အသည်းအသည်းဆဲလ်များ ကင်ဆာ (LIHC)၊ ကျောက်ကပ်ကျောက်ကပ်ဆိုင်ရာ ဆဲလ်ကင်ဆာ (KIRP) နှင့် အူမကြီး adenocarcinoma (COAD) (p တန်ဖိုး < 0.05) (ပုံ။ 1e–m) .တွဲထားသည့် ကျန်းမာသော/အကျိတ်နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (BLCA)၊ ကြည်လင်သောဆဲလ်ကျောက်ကပ်နှင့် ကျောက်ကပ်ဆဲလ်ကင်ဆာ (KIRC)၊ ဆီးကျိတ် adenocarcinoma (PRAD)၊ lung squamous cell carcinoma (LUSC) အကျိတ်များတွင် DARS-AS1 ၏ သိသိသာသာ ပိုမိုမြင့်မားသောဖော်ပြမှုကို အတည်ပြုပါသည်။, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– မီတာ)။ သားအိမ်အတွင်းသားကင်ဆာ (UCEC)၊ အဆုတ်၏ adenocarcinoma (LUAD)၊ အသည်းဆဲလ်ကင်ဆာ (LIHC)၊ ကျောက်ကပ်၏ papillary cell carcinoma (KIRP)၊ နှင့် အူမကြီးကင်ဆာ (COAD) (p တန်ဖိုး < 0.05) (ပုံ။ 1e– m)။配对 / 肿瘤样本的的进一步进一步证实证实证实了了了了了了 as as 在膀胱尿路上上 (BLCA), 肾肾透明细胞癌透明 (kir), 前列腺腺癌透明细胞癌 (kir), 前列腺腺癌 (Prad), 肺鳞状细胞癌 (lusc) 肿瘤中中中显着更高表达，子宫体子宫 的更多内容<0.05) (图1e-m)။对对 / 肿瘤样本的的分析证实了了了皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌前列细胞癌腺腺癌腺腺癌腺腺癌腺腺癌前列腺腺癌前列细胞癌细胞癌前列腺腺癌(lusc) 肿瘤中中中中中中中中中中中中中中中中中中中显着显着更显着显着更显着更高更显着高更高表达更高高表达表达表达表达表达表达表达表达表达表达表达表达表达癌癌癌癌癌 ((Ucel) 肝肝肝肝 (Liad) 肾肾肾肾肾细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m)။ကျန်းမာသော/အကျိတ်တွဲထားသောနမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ဆီးအိမ် urothelial carcinoma (BLCA)၊ ကြည်လင်သောဆဲလ်ကျောက်ကပ်ကင်ဆာ (KIRC)၊ ဆီးကျိတ် adenocarcinoma (PRAD) နှင့် အဆုတ် squamous cell carcinoma (LUSC) အကျိတ်များတွင် DARS-AS1 ၏အခန်းကဏ္ဍကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m)။ corpus uterine carcinoma (UCEC)၊ အဆုတ် adenocarcinoma (LUAD)၊ hepatocellular carcinoma (LIHC)၊ renal papillary cell carcinoma (KIRP) နှင့် colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (ပုံ 1e -m)။စုစည်း၍ ဤရလဒ်များက DARS-AS1 သည် ကင်ဆာအမျိုးမျိုးတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်နှင့် အလွန်အမင်းဖော်ပြကြောင်း ဖော်ပြသည်။
DARS-AS1 နှင့် DARS (ဗီဇကုဒ်သွင်းသည့် ပိုးမွှားကြိုးမျှင်) သည် တူညီသောမြှင့်တင်မှုအား မျှဝေထားပြီး တစ်ခုနှင့်တစ်ခုဘေးတွင် တည်ရှိသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် shRNA ကို အထူးတလည် ဖြိုချရန် DARS-AS1 သို့ သော် DARS (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 2a၊ b နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 2) ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ထားပါသည်။ .SW620 အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် shRNA နှောင့်နှေးခြင်း (နောက်ဆက်တွဲဇယား 3) ၏ ထိရောက်မှုနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်များကို လေ့လာရန် DARS-AS1 ကို မြင့်မားစွာဖော်ပြသည့် အခြားဆဲလ်လိုင်းသုံးခုကိုလည်း အသုံးပြုခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက DARS mRNA ပမာဏအပေါ် အနည်းငယ်အကျိုးသက်ရောက်မှုဖြင့် တီထွင်ထားသော shRNA သုံးခုစလုံးသည် အနည်းဆုံး 80% DARS-AS1 ကျဆင်းမှုထိရောက်မှုကို ရရှိခဲ့ကြောင်း ညွှန်ပြခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ ဤ shRNA များနှင့်အတူ DARS-AS1 နှိမ့်ချခြင်းသည် အူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်လိုင်းများ SW620 (49.7%) နှင့် HCT116 (27.7%)၊ ရင်သားကင်ဆာဆဲလ်လိုင်း MBA-MD-231 (53.4%) ရှိ ဆဲလ်များကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ ဟန့်တားစေသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။) နှင့် HepG2 အသည်းဆဲလ်လိုင်း (92.7% လျော့ချရေး) နှင့် ၎င်းတို့၏ သည်းမခံသော စက်လုံးများ ဖွဲ့စည်းနိုင်မှု (ပျမ်းမျှအားဖြင့် ~50.8%, 44.6%, 40.7% နှင့် 75.7% ဆဲလ်လိုင်းတစ်ခုစီ) (ပုံ. 2a,b)။SW620 တွင်၊ ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းခြင်းဆိုင်ရာ ဆန်းစစ်မှု၏ရလဒ်များက DARS-AS1 shRNA သည် ပျမ်းမျှအားဖြင့် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 69.6% လျော့နည်းသွားပြီး ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုကို သိသာထင်ရှားစွာ ဟန့်တားကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။
ထိန်းချုပ်မှု shRNA နှင့် DARS-AS1 shRNA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုသည် SW620၊ HCT116၊ MBA-MD-231၊ နှင့် HepG2 ဆဲလ်များရှိ ဆဲလ်များကြီးထွားမှု (a) နှင့် spheroid များဖွဲ့စည်းခြင်း (b) အပေါ်သက်ရောက်မှု။c ထိန်းချုပ်မှု shRNA နှင့် DARS-AS1 shRNA ၏ SW620 ဆဲလ်များတွင် ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းခြင်းအပေါ် သက်ရောက်မှု။ဆဲလ်ပြန့်ပွားခြင်း (ဃ)၊ စဖရွိုက်ဖွဲ့စည်းမှု (င)၊ နှင့် DARS-AS1 ကိုဖော်ပြသော SW620 ဆဲလ်များ၏ ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းခြင်း (စ)။ပြထားသောဒေတာများသည် စမ်းသပ်မှုသုံးခု၏ ပျမ်းမျှ±စံသွေဖည်မှုဖြစ်သည်။* p ≤ 0.05၊ ** p ≤ 0.01 နှင့် *** p ≤ 0.001 နှစ်မြီးရှိသော ကျောင်းသား၏ t-test ။
ဆုံးရှုံးမှု-လုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာလေ့လာမှုများကို ဖြည့်စွက်ရန်အတွက် DARS-AS1 (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2g) အလွန်အကျွံဖော်ပြသည့် SW620 ဆဲလ်များကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖန်တီးခဲ့သည်။DARS-AS1 လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းသည် ဆဲလ်ကြီးထွားမှု (1.8 ဆ)၊ ရပ်တန့်ထားသော spheroid ဖွဲ့စည်းမှု (1.4-ဆ) နှင့် SW620 ဆဲလ်များတွင် ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းခြင်း (3.3-ဆ) သိသိသာသာတိုးလာသည် (ပုံ။ 2d-f)။အခြား DARS-AS1 ဖော်ပြသည့်ဆဲလ်လိုင်း A549 ကို အသုံးပြု၍ ဤရလဒ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ အတည်ပြုခဲ့သည်။DARS-AS1 လွန်ကဲစွာဖော်ပြမှုကြောင့် ဤအဆင့်မြှင့်တင်ထားသောဆဲလ်ပေါက်ပွားမှုကို A549 ဆဲလ်များ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2h၊ i နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 3) တွင် ထပ်မံတွေ့ရှိရပါသည်။ပေါင်းစပ်ပြီး၊ ဤအမြတ်အရှုံး လေ့လာမှုများက DARS-AS1 သည် ကင်ဆာဆဲလ်များ ဗီတိုအတွင်း ပြန့်ပွားမှုကို အားပေးကြောင်း သက်သေပြသည်။
DARS-AS1 သည် ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် အရင်းခံ ယန္တရားအား ရှာဖွေရန်၊ ၎င်း၏ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ပရိုတိန်းချိတ်တွဲဖက်များကို ဖော်ထုတ်ရန် RNA ဆွဲချမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။RT-qPCR ရလဒ်များအရ DARS-AS1 ၏ 86.2% ခန့်သည် SW620 ဆဲလ်များ၏ cytoplasm တွင်တည်ရှိသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3a) ကိုပြသခဲ့သည်။ထို့နောက် in vitro transcribed biotinylated DARS-AS1 သို့မဟုတ် pseudoRNA ကို SW620 cell lysates ဖြင့် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် SDS-PAGE ခွဲခြားခြင်းဖြင့် ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။နောက်ဆက်တွဲ ငွေရောင်စွန်းထင်းမှုတွင် ထူးခြားသော တီးဝိုင်းတစ်ခု (~38 kDa) သည် DARS-AS1 ဆွဲထုတ်နမူနာများတွင် သိသာထင်ရှားစွာ ကြွယ်ဝလာသော်လည်း dummy RNA သို့မဟုတ် ပုတီးစေ့နမူနာများတွင် မပါရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3a)။ဤတီးဝိုင်းအား PKR အသက်ဝင်သောပရိုတိန်း (PACT) အဖြစ် အစုလိုက်အပြုံလိုက် တိုင်းတာမှု (MS) ဖြင့် သတ်မှတ်ခဲ့ပြီး SW620၊ HCT116၊ နှင့် HepG2 ဆဲလ်လိုင်းများ (ပုံ. 3a,b) တွင် ခုခံအားကျဆင်းစေခြင်းဖြင့် ထပ်မံအတည်ပြုခဲ့သည်။DARS နှင့် ဆက်စပ် PACT ပရိုတိန်းများ - PKR နှင့် TRBP ၏ ကြွယ်ဝမှုကို Western blotting (WB) မှ RNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍လည်း စုံစမ်းခဲ့သည်။ရလဒ်များက DARS-AS1 RNA နှင့် ဤပရိုတိန်းသုံးမျိုးကြား တိုက်ရိုက်အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို မတွေ့ရှိရကြောင်း ရလဒ်များက ဖော်ပြခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 3b)။DARS-AS1 နှင့် PACT အကြား သီးခြားအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို RNA immunoprecipitation (RIP) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ DARS-AS1 သည် ဆန့်ကျင်ဘက် PACT ပဋိပစ္စည်းများတွင် သိသိသာသာကြွယ်ဝသော်လည်း အခြားထိန်းချုပ်မှု RNA များမဟုတ်ပါ (ပုံ 3c) ကိုပြသခဲ့သည်။DARS-AS1 သည် အခြားဆယ်လူလာ အစိတ်အပိုင်းများ မရှိသဖြင့် PACT နှင့် တိုက်ရိုက် တုံ့ပြန်မှုရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ in vitro biolayer interferometry (BLI) စစ်ဆေးမှုအား သန့်စင်ထားသော PACT ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။Biotin-တံဆိပ်တပ်ထားသော DARS-AS1 သို့မဟုတ် dummy RNA ကို streptavidin (SA) ဇီဝအာရုံခံကိရိယာများပေါ်တွင် ရွှေ့ပြောင်းထားပြီး 1 μM PACT ပါရှိသော kinetic ကြားခံတွင် ပေါက်ဖွားသည်။ထင်ရှားသည်မှာ၊ PACT သည် DARS-AS1 (KD တန်ဖိုး ~26.9 nM) နှင့် ခိုင်ခိုင်မာမာ ချည်နှောင်ထားသော်လည်း RNA (ပုံ 3d) ကိုတုပရန် မဟုတ်ပါ။အတူတကွလုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့်၊ ဤရလဒ်များသည် DARS-AS1 နှင့် PACT အကြား တိုက်ရိုက်အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုနှင့် မြင့်မားသောရင်းနှီးမှုကို ပြသသည်။
RNA ဆွဲယူခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု SW620 ဆဲလ်များရှိ DARS-AS1 သည် PACT နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။အထက်တွင်၊ ဆက်စပ်ပရိုတိန်း၏ငွေရောင်စွန်းခြင်း။အောက်ပိုင်း immunoblots များကို anti-PACT ပဋိပစ္စည်းဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။b RNA ဆွဲချခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို HCT116 (အပေါ်) နှင့် HepG2 (အောက်ခြေ) ဆဲလ်များတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။Immunoblotting ဖြင့် PACT ကြွယ်ဝမှုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။cRNA immunoprecipitation (RIP) စစ်ဆေးမှုများကို ညွှန်ပြထားသော ပဋိပစ္စည်းများကို အသုံးပြု၍ SW620 ဆဲလ်များတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။d PACT သည် biolayer interferometry (BLI) ကို အသုံးပြု၍ DARS-AS1 သို့မဟုတ် ထိန်းချုပ်မှု RNA နှင့် အပြည့်အ၀ ချိတ်ဆက်ထားသော မျဉ်းကွေးများကို ရယူခဲ့သည်။RNA ကို streptavidin ဇီဝအာရုံခံကိရိယာတစ်ခုပေါ်တွင် ချုပ်နှောင်ထားသည်။အသင်းအဖွဲ့ကိုတိုင်းတာရန် 1 μM PACT ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။e RNA ဆွဲထုတ်ခြင်း စစ်ဆေးမှုအား biotinylated full-length DARS-AS1 သို့မဟုတ် ဖြတ်တောက်ထားသော (အပေါ်ပိုင်း) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။လက်ခံရရှိထားသော PACT ကိုပြသသည့် Immunoblot (အောက်ခြေ)။f သန့်စင်ထားသော အလံပြထားသော PACT အား ဇီဝသေးငယ်သော အစအဆုံး DARS-AS1 ဖြင့် ပေါက်ဖွားခဲ့သည် သို့မဟုတ် in vitro RIP စစ်ဆေးမှုအတွက် (င) ကဲ့သို့ ဖြတ်တောက်ထားသည်။ထုတ်ယူထားသော RNA ကို RT-qPCR မှ စစ်ဆေးခဲ့သည်။g PACT အတွက် မတူညီသော RNA အပိုင်းအစများ၏ နှိုင်းရရင်းနှီးမှုအား biolayer interferometry ကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့သည်။ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် 100 nM RNA နှင့် 1 μM RAST ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။h in vitro RIP စစ်ဆေးမှုများကို သန့်စင်ထားသော နဂိုအတိုင်း သို့မဟုတ် ဖြတ်တောက်ထားသော PACT တံဆိပ်တပ်ထားသော အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ထုတ်ယူထားသော RNA ကို RT-qPCR မှ စစ်ဆေးခဲ့သည်။i DARS-AS1၊ PACT သို့မဟုတ် နှစ်ခုစလုံးကို ဖော်ပြသော SW620 ဆဲလ်များ၏ ကြီးထွားနှုန်း။j SW620 ဆဲလ်များရှိ DARS-AS1 ၏ အစအဆုံး သို့မဟုတ် ဖြတ်တောက်ထားသော DARS-AS1 ကို အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းသည် ဆဲလ်ကြီးထွားမှုအပေါ် မတူညီသောအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိသည်။k Apoptosis ကိုဆန့်ကျင် PARP ပဋိပစ္စည်းဖြင့် immunoblotting လုပ်ခြင်းဖြင့်တွေ့ရှိခဲ့သည်။l DARS-AS1 ၏နောက်လိုက်သည် flow cytometry ဖြင့်ပြသထားသည့်အတိုင်း SW620 ဆဲလ်များ၏ apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။ပြထားသောဒေတာများသည် စမ်းသပ်မှုသုံးခု၏ ပျမ်းမျှ±စံသွေဖည်မှုဖြစ်သည်။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t စမ်းသပ်မှု။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t စမ်းသပ်မှု။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001 ကျောင်းသား၏ t-test ဖြင့်။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ။ *p ≤ 0.05၊ **p ≤ 0.01၊ ***p ≤ 0.001၊ ****p < 0.0001 ကျောင်းသား၏ t-test ဖြင့်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် PACT အသင်းအဖွဲ့ (ပုံ 3e) အတွက် လိုအပ်သော DARS-AS1 ဒေသကို သိရှိနိုင်စေရန်အတွက် ဇီဝရုပ်တုပြုလုပ်ထားသော DARS-AS1 RNA အပိုင်းသုံးပိုင်းကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။RNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုရလဒ်များသည် အပိုင်းတစ်ခုစီသည် PACT နှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်နိုင်သည်ကိုပြသခဲ့သည်၊ သို့သော် 3′-terminal ဒေသ (A3 တံဆိပ်ပါသော 384–768 nucleotides) သည် A1 တံဆိပ်တပ်ထားသော 1–384 nucleotides ထက်ပို၍ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3e)။ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော PACT (ပုံ 3f) ကို အသုံးပြု၍ in vitro RIP စစ်ဆေးမှုတွင် အလားတူရလဒ်များကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤရလဒ်များနှင့် ကိုက်ညီသော BLI ကို အသုံးပြု၍ PACT နှင့် ချည်နှောင်ထားသော RNA အပိုင်းအစများကို ချည်နှောင်ရန် လက်တွေ့စမ်းသပ်ချက်များအရ PACT သည် A3 (384–768 nt) (KD တန်ဖိုး ခန့်မှန်းခြေ 94.6 nM) နှင့် ချိတ်ဆက်မှု မရှိသလောက်ဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။(ပုံ။ 3d)။
PACT ရှိ ဆက်စပ် ချိတ်ဆက်ထားသော ဒေသများကိုလည်း စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။PACT တွင် လုပ်ဆောင်နိုင်သော ဒိုမိန်း သုံးခု ပါ၀င်ပြီး ၎င်းတို့ထဲမှ နှစ်ခုသည် ထိန်းသိမ်းထားသော နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော RNA-binding domains (dsRBD) နှင့် ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့် တတိယဒိုမိန်း (သတ်မှတ်ထားသော D3) ပါဝင်သည်။ဒိုမိန်းတစ်ခုစီ၏ lncRNA ချိတ်ဆက်နိုင်မှုစွမ်းရည်ကို စစ်ဆေးရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဒိုမိန်းသုံးခုတစ်ခုစီကို ဖယ်ရှားပြီး ဗီတို RIP စစ်ဆေးမှုတစ်ခုပြုလုပ်သော ဗီဇပြောင်းလဲမှုသုံးခုကို တီထွင်ခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက PACT ၏တတိယဒိုမိန်း (D3) ကို ဖျက်လိုက်ခြင်းသည် DARS-AS1 နှင့် ၎င်း၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို သိသိသာသာလျော့ကျသွားစေသည် (နဂိုအတိုင်း PACT နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 0.11 ဆ) လျော့နည်းသွားကြောင်းပြသခဲ့သည် D3 သည် DARS နှင့် တုံ့ပြန်ခဲ့သည်။-AC1။စုစည်းထားသော ဤရလဒ်များသည် DARS-AS1 နှင့် PACT အကြား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် DARS-AS1 ၏ 3′ အဆုံးနှင့် PACT ၏ D3 ဒိုမိန်းမှတဆင့် အဓိကအားဖြင့် ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
DARS-AS1 သည် PACT ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုအပေါ် သက်ရောက်မှုမရှိကြောင်း၊ PACT သည် DARS-AS1 (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3c) ပေါ်တွင် သက်ရောက်မှုမရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ မှတ်သားထားပါသည်။ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် PACT ၏ ဆဲလ်ကြီးထွားမှုအပေါ် နှောင့်နှေးစေသော အကျိုးသက်ရောက်မှုကို စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။DARS-AS1 နှင့်မတူဘဲ၊ PACT ပြိုကျသောအခါ ဆွေမျိုးဆဲလ်များသည် 1.5-3 ဆ ပိုမြန်လာသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3d)။ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းခြင်းဆိုင်ရာ ဆန်းစစ်မှု၏ရလဒ်များက ဆဲလ်များသည် PACT (နောက်ဆက်တွဲပုံ 3e) ဖြင့် shRNA ကုသမှုပြီးနောက် 2-3-ဆသော ကိုလိုနီများဖြစ်ပေါ်လာကြောင်း ညွှန်ပြသည်။DARS-AS1 သည် PACT မှတစ်ဆင့် ဆဲလ်များပေါက်ပွားမှုကို ထိန်းညှိခြင်း ရှိ၊ မရှိ စမ်းသပ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် PACT၊ DARS-AS1 သို့မဟုတ် နှစ်ခုစလုံးကို ဖော်ပြလွန်းသည့် SW620 ဆဲလ်များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။PACT ၏ အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းသည် ဆဲလ်ပွားခြင်းကို သိသိသာသာ ဟန့်တားခြင်းဖြစ်သည် (ပုံ 3i)။DARS-AS1 သည် ဆဲလ်ပွားနှုန်းကို သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးသော်လည်း DARS-AS1 နှင့် PACT လွန်ကဲသော ဆဲလ်များ၏ ကြီးထွားနှုန်းမှာ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားမှု မရှိပေ။ဤရလဒ်များက PACT သည် DARS-AS1 လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းကြောင့် တိုးပွားလာမှုကို တန်ပြန်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
DARS-AS1 ၏ မတူညီသော ဒေသများတွင် မတူညီသော PACT-binding စွမ်းရည်များ ရှိသည်ဖြစ်သောကြောင့်၊ ကွဲပြားသော DARS-AS1 အပိုင်းအစများကို ကွဲပြားစွာဖော်ပြခြင်းဖြင့် ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုအပေါ် ၎င်းတို့၏ ဆွေမျိုးသြဇာလွှမ်းမိုးမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။အခြားအပိုင်းနှစ်ပိုင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DARS-AS1 သည် ဆဲလ်ကြီးထွားမှုကို လှုံ့ဆော်နိုင်စွမ်း အမြင့်ဆုံးဖြစ်သော DARS-AS1 ရှိ ပင်မ PACT ဆိုင်ရာ ဒေသဖြစ်သည့် 3′ အဆုံး (384–768 nt) တွင် အလွန်အကျွံဖော်ပြခဲ့သည်။ဤရလဒ်များသည် DARS-AS1 ၏ ပေါင်းစပ်စွမ်းရည်နှင့် ဇီဝဗေဒလုပ်ဆောင်မှုအကြား အပြုသဘောဆောင်သော ဆက်စပ်ဆက်စပ်မှုကို ညွှန်ပြသည်။
PACT သည် apoptotic ပရိုတင်း 19 ဖြစ်သည်ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် apoptosis အပေါ် DARS-AS1 ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ DARS-AS1 နှောင့်နှေးမှုသည် SW620 ဆဲလ်များတွင် PARP ကွဲထွက်မှုကို သိသာထင်ရှားစွာတိုးပွားစေပြီး SW620၊ HCT116၊ HepG2၊ နှင့် MBA-MD-231 ဆဲလ်လိုင်းများ (ပုံ။ 3k) ရှိ annexin V-positive ဆဲလ်များ၏အချိုးအစားကို တိုးစေသည်။၃)။3f–h) ကင်ဆာဆဲလ်များရှိ DARS-AS1 ၏ဆန့်ကျင်ဘက်ဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုသည် PACT ၏ apoptosis-inducing function နှင့်ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်ကြောင်းညွှန်ပြသည်။စုစည်းထားသော ဤရလဒ်များသည် DARS-AS1 oncogenic လုပ်ဆောင်မှု၏ယန္တရားသည် PACT လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် DARS-AS1-PACT အသင်းအဖွဲ့၏ လုပ်ငန်းဆောင်တာ သက်ရောက်မှုများကို စူးစမ်းလေ့လာခဲ့သည်။နောက်ပိုင်းတွင် eIF2α phosphorylation ကို တိုးမြှင့်စေပြီး ဘာသာပြန်ဆိုမှု ဖျက်ခြင်းနှင့် apoptosis17 ကိုဖြစ်စေသည့် တိုက်ရိုက်အပြန်အလှန်အားဖြင့် PKR ကို အသက်သွင်းရန် PACT အား အစီရင်ခံထားပါသည်။ဦးစွာ၊ DARS-AS1 သည် PACT နှင့် PKR ၏ ဆယ်လူလာဒေသသတ်မှတ်ခြင်းကို သက်ရောက်မှုရှိမရှိ စစ်ဆေးခဲ့သည်။Confocal fluorescence microscopy မှ PACT နှင့် PKR တို့သည် ပျမ်းမျှ Pearson ဆက်စပ်ကိန်း 0.72 ရှိသော SW620 ဆဲလ်များတွင် မြင့်မားစွာ colocalized ပြုလုပ်ထားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။တစ်ချိန်တည်းတွင်၊ DARS-AS1 သည် အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းသည် PACT နှင့် PKR ပူးတွဲဒေသသတ်မှတ်ခြင်း (ဆိုလိုသည်မှာ Pearson ဆက်စပ်ကိန်းဂဏန်း 0.61) (ပုံ 4a) ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည်။DARS-AS1 သည် PACT-PKR အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲနိုင်မညကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SW620 ဆဲလ် lysates တွင် anti-PACT ပဋိပစ္စည်းဖြင့် ပူးတွဲကိုယ်ခံအားကျခြင်း (co-IP) စစ်ဆေးမှုတစ်ခုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။PKR သည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များရှိ anti-PACT တွင် ကြွယ်ဝစွာပါဝင်ပြီး PKR ပြန်လည်ရယူခြင်းသည် DARS-AS1 (ပုံ. 4b) လွန်ကဲသောဆဲလ်များမှ lysates တွင် lysates သိသိသာသာလျော့ကျသွားသည်။သန့်စင်ထားသော PACT နှင့် PKR တံဆိပ်တပ်ထားသော in vitro protein binding assays အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ထို့ကြောင့်၊ DARS-AS1 ကို ပံ့ပိုးပေးသော်လည်း ထိန်းချုပ်မှုမရှိသော RNA သည် PACT-PKR အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို ဖိနှိပ်ထားသည် (ပုံ 4c) ကိုပြသခဲ့သည်။ရလဒ်များအားလုံးသည် DARS-AS1 သည် PACT နှင့် PKR ဆက်သွယ်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။
ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် PKR ၏ DARS-AS1 ကို ပိုမိုဖော်ပြသော ဆဲလ်များတွင် PACT နှင့် PKR ၏ ပူးတွဲဒေသခံအဖြစ်သတ်မှတ်ခြင်းကို confocal fluorescence microscopy အသုံးပြု၍ လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။နျူကလိယကို DAPI ဖြင့် စွန်းထင်းခဲ့သည်။ဓါတ်ပုံ ၁၆ ပုံမှ ကိန်းဂဏန်းရလဒ်များကို ရရှိခဲ့သည်။b ထိန်းချုပ်မှု SW620 ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် DARS-AS1 လွန်ကဲစွာဖော်ပြသောဆဲလ်များ၏ ဆဲလ် lysates များတွင် anti-PACT ပဋိပစ္စည်းကို အသုံးပြု၍ Co-immunoprecipitation (co-IP)။c တံဆိပ်တပ်ထားသော PACT၊ သန့်စင်ထားသော PKR နှင့် DARS-AS1 သို့မဟုတ် mock RNA ဖြင့် vitro တွင် ရေးသွင်းထားသော in vitro protein binding analysis အတွက် ပေါက်ဖွားလာခြင်းဖြစ်သည်။ခုခံအားကျဆင်းခြင်းအတွက် အလံဆန့်ကျင်ဘော်ဒီများကို အသုံးပြုခဲ့သည်။d ညွှန်ပြသောပဋိပစ္စည်းပါရှိသော Immunoblots များကို SW620 နှင့် HCT116 ထိန်းချုပ်မှု shRNA သို့မဟုတ် DARS-AS1-shRNA ဖြင့်ကူးစက်သောဆဲလ်များတွင်လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီးနောက်တွင်သွေးရည်ကြည်ငတ်မွတ်မှု။e DARS-AS1 ဖော်ပြမှုအဆင့်များသည် thapsigargin သို့ ဆဲလ်လူလာ အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို ပြောင်းလဲစေသည်။SW620 ဆဲလ်များကို DARS-AS1 shRNA၊ DARS-AS1 overexpression plasmid သို့မဟုတ် control plasmid တို့ဖြင့် ကူးစက်သွားပါသည်။ဆဲလ်များကို 48 နာရီကြာ thapsigargin ဖြင့် ကုသခဲ့ပြီး MTS ဓာတ်ပစ္စည်းများကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ်များ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။f in vitro transcribed DARS-AS1 သို့မဟုတ် dummy RNA နှင့် သန့်စင်ထားသော PACT ကို in vitro activation assay နှင့် immunoblot detection အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။g ဤပဋိပစ္စည်းကိုအသုံးပြုထားသော Immunoblots များကို SW620-ctrl ဆဲလ်များ (ဘယ်ဘက်) သို့မဟုတ် PKR mutants (ညာဘက်) တွင်ဖော်ပြသောဆဲလ်များပေါ်တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ထို့နောက် ဤဆဲလ်များသည် ထိန်းချုပ်မှု shRNA သို့မဟုတ် DARS-AS1-shRNA ဖြင့် ကူးစက်ပြီးနောက် သွေးရည်ကြည် ငတ်မွတ်မှုဖြင့် ကူးစက်သွားခဲ့သည်။h Flow cytometry သည် SW620 ဆဲလ်များရှိ DARS-AS1-induced apoptosis အတွက် လျော်ကြေးပေးသည့် mutant PKR သည် လျော်ကြေးပေးကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ညွှန်ပြထားသော ပဋိပစ္စည်းပါရှိသော immunoblots များကို SW620 (ဘယ်) သို့မဟုတ် HCT116 (ညာဘက်) ဆဲလ်များတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ထိန်းချုပ်မှု shRNA သို့မဟုတ် DARS-AS1 shRNA ဖြင့် ကူးစက်သော ဆဲလ်များသည် သွေးရည်ကြည်မှ မရရှိဘဲ 100 nM PKR C16 inhibitor သို့မဟုတ် DMSO ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။စကေးဘား = 5 µm ။ပြထားသောဒေတာများသည် စမ်းသပ်မှုသုံးခု၏ ပျမ်းမျှ±စံသွေဖည်မှုဖြစ်သည်။* p ≤ 0.05 two-tailed Student's t-test.
PACT သည် PKR17 နှင့် တုံ့ပြန်သည်နှင့် တပြိုင်နက် PKR phosphorylation ကို Thr451 တွင် လှုံ့ဆော်နိုင်သည်ဟု ယေဘုယျအားဖြင့် ယုံကြည်ကြသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ PKR phosphorylation အဆင့်သည် သွေးရည်ကြည်ငတ်မွတ်ပြီးနောက် DARS-AS1 ဆဲလ်များတွင် သိသာထင်ရှားစွာ မြင့်မားလာသည် (ပုံ။ 4d နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4a)။ထို့ကြောင့်၊ ပင်မ PKR အလွှာဖြစ်သော eIF2α ၏ phosphorylation သည် DARS-AS1 shRNA (ပုံ 4d နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 4a) တို့မှလည်း သိသာထင်ရှားစွာ တိုးလာသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။Thapsigargin သည် ER အား Ca2+ ကိုထုတ်လွှတ်စေသော ER stressor တစ်ခုဖြစ်သည်။thapsigargin ဖြင့် ကုသခြင်းသည် PACT ၏အသုံးအနှုန်းနှင့် အသက်ဝင်မှုကို လှုံ့ဆော်ရန် အစီရင်ခံထားပြီး၊ ၎င်းသည် PKR နှင့် ထပ်မံအကျိုးသက်ရောက်ပြီး eIF2α phosphorylation 18,61 ကိုတိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် DARS-AS1 သည် PACT/PKR လမ်းကြောင်းကို ဟန့်တားခြင်းဖြင့် ဆဲလ်များကို ဖိစီးမှုကို ကျော်လွှားနိုင်သည်ရှိမရှိ စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် PACT/PKR လမ်းကြောင်း၏ လှုံ့ဆော်ပေးသူအဖြစ် thapsigargin ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။DARS-AS1 ဖော်ပြချက်အဆင့်သည် thapsigargin ၏ဆဲလ်ခံနိုင်ရည်နှင့် အပြုသဘောဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။DARS-AS1 ကိုဖော်ပြခြင်းလွန်ကဲသော SW620 ဆဲလ်များသည် thapsigargin ဖြင့် ကုသသောအခါတွင် ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ ရှင်သန်ခဲ့ပြီး DARS-AS1 နှိမ့်ချသောဆဲလ်များသည် ပိုမိုခံရနိုင်သည် (ပုံ။ 4e)။ဤရလဒ်များနှင့် ကိုက်ညီပါက DARS-AS1 လွန်ကဲစွာဖော်ပြမှုသည် thapsigargin-induced PKR phosphorylation (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4b) ကို လျှော့ချသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ thapsigargin ကုသမှုပြီးနောက်၊ PKR နှင့် eIF2α တို့သည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DARS-AS1 ဆဲလ်များအတွင်း ဖော့စဖိုရီအဖြစ် ပိုမိုမြင့်မားစွာလုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4b)။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ thapsigargin သည် DARS-AS1 ၏ စိတ်ဖိစီးမှုကို ဆန့်ကျင်သည့်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ညွှန်ပြနိုင်သည့် DARS-AS1 ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုကို ပမာဏအလိုက် လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်များကို အတည်ပြုရန် vitro activation assays ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ PKR သည် ဆန့်ကျင်ဘက် PKR ပဋိပစ္စည်းကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ် lysates မှ သန့်စင်ခဲ့ပြီး၊ ထို့နောက် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော PACT နှင့် DARS-AS1 တို့ကို vitro တွင် ကူးယူဖော်ပြပါသည်။အင်ဇိုင်းတုံ့ပြန်မှုပြီးနောက်၊ ဖော့စဖို-PKR ကို WB အသုံးပြု၍ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက PKR phosphorylation ကို DARS-AS1 မှ သိသိသာသာ ဟန့်တားထားသော်လည်း ထိန်းချုပ်မှု RNA (ပုံ 4f) မှမဟုတ်ကြောင်း ဖော်ပြသည်။၎င်းတို့သည် vitro နှင့် vivo ရလဒ်များတွင် DARS-AS1 သည် PACT-mediated PKR activation ကို ဟန့်တားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ DARS-AS1 (ပုံ 4f) ၏ရှေ့မှောက်တွင် PACT ပြန်လည်ရယူမှု ကျဆင်းသွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့လည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤရလဒ်သည် in vitro protein binding assay (ပုံ 4c) ၏ရလဒ်များနှင့် ကိုက်ညီပြီး PACT-PKR အသင်းအဖွဲ့အတွက် DARS-AS1 ၏ ပိတ်ဆို့ခြင်းလုပ်ဆောင်ချက်ကို ထပ်မံသရုပ်ဖော်သည်။
PACT ၏ D3 ဒိုမိန်းရှိ Ser246 နှင့် Ser287 တို့သည် ဆဲလ်လူလာဖိစီးမှုအောက်တွင် PKR အသက်သွင်းရန်အတွက် လိုအပ်သည်။Alanine အတွက် serine အကြွင်းအကျန်နှစ်ခု၏ အစားထိုးမှုသည် စိတ်ဖိစီးမှုမရှိချိန်တွင် PKR ကို အသက်သွင်းပေးသည့် mutant PACT (mutD) နှင့် alanine (mutA) ကို အစားထိုးခြင်းဖြင့် ပရိုတိုကောကို ပြောင်းပြန်ဖြစ်သည်။DARS-AS1 နှင့် တိုက်ရိုက်ဆက်စပ်မှုတွင် ဤဒိုမိန်း၏ အရေးပါမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြထားသောကြောင့်၊ ဤအကြွင်းအကျန်များသည် DARS-AS1 နှင့် အပြန်အလှန်ဆက်စပ်မှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန်အတွက် ဤ PACT မျိုးပြောင်းနှစ်မျိုးကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ မျိုးပြောင်းနှစ်မျိုးလုံးသည် DARS-AS1 (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4d) နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်စွမ်း ဆုံးရှုံးသွားသည်မှာ PACT ပရိုတင်း၏ ပြီးပြည့်စုံသောဖွဲ့စည်းပုံမှာ DARS-AS1 နှင့် ထိရောက်သောအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအတွက် လိုအပ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် DARS-AS1-shRNA ကြောင့် ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုကို ဟန့်တားခြင်းအား တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော PACT mutant (PACTmutA) သို့မဟုတ် လွှမ်းမိုးထားသော အနုတ်လက္ခဏာ PKR mutant (PKRmut) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 4e. e) ကိုဖော်ပြခြင်းဖြင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ပြန်လည်ရရှိနိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက အကြံပြုပါသည်။လွှမ်းမိုးထားသော-အနုတ်လက္ခဏာ PKR mutants များကို လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းက DARS-AS1 နှောင့်နှေးမှုကြောင့် ဖြစ်စေသော PKR phosphorylation နှင့် သွေးရည်ကြည်မရရှိသောဆဲလ်များရှိ eIF2α phosphorylation (ပုံ။ 4g) ကို လျော့နည်းစေသည်။ပို၍အရေးကြီးသည်မှာ၊ DARS-AS1 နှိုက်နှိုက်နှိုက်ချွတ်ချွတ်ချွတ်ယွင်းသော apoptotic ဆဲလ်များ၏အချိုးအစားသည် PKRmut (ပုံ။ 4h နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4g) ကိုလည်း လျှော့ချခဲ့သည်။PKR kinase လုပ်ဆောင်ချက်ကို တားမြစ်ခြင်းသည် DARS-AS1 လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိခိုက်စေပါသည်၊ ရလဒ်များအရ DARS-AS1 သည် ဆဲလ်များကို PKR သီးသန့် C16 inhibitor (ပုံ 4i နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4h) ဖြင့် ကုသသောအခါတွင် PKR နှင့် eIF2α phosphorylation ကို စတင်ခဲကြောင်း ရလဒ်များက ပြသခဲ့သည်။)ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက DARS-AS1 သည် PACT-mediated PKR လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်းဖြင့် အနည်းဆုံးတစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုကို အားပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
tumorigenesis တွင် DARS-AS1 ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ထပ်မံလေ့လာရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် mouse xenograft မော်ဒယ်ကို အသုံးပြု၍ vivo စမ်းသပ်မှုများတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ ရလဒ်များက DARS-AS1 သည် ကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှု သိသိသာသာ လျော့ကျသွားကြောင်း ပြသသည် (p တန်ဖိုး < 0.0001) (ပုံ။ 5a)။ ရလဒ်များက DARS-AS1 သည် ကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှု သိသိသာသာ လျော့ကျသွားကြောင်း ပြသသည် (p တန်ဖိုး < 0.0001) (ပုံ။ 5a)။ Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. ရလဒ်များအရ DARS-AS1 သည် ကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ လျှော့ချပေးသည် (p value < 0.0001) (ပုံ 5a)။结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）။结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）။ Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001)။ ရလဒ်များက DARS-AS1 သည် ကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေကြောင်း ရလဒ်များက ပြသခဲ့သည် (p value < 0.0001) (ပုံ 5a)။ထို့ကြောင့် DARS-AS1 knockdown အုပ်စုတွင်၊ ပျမ်းမျှအကျိတ်ပမာဏ 72.9% ခန့်နှင့် အကျိတ်ပမာဏ 87.8% ခန့် (ပုံ 5b-d) တွင် သိသာထင်ရှားစွာ ကျဆင်းသွားပါသည်။ဤရလဒ်များသည် DARS-AS1 သည် vivo တွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးနိုင်ကြောင်း အခိုင်အမာ အကြံပြုထားသည်။
ကြော်ငြာ DARS-AS1 ၏ ညစ်ညမ်းသော ကြွက်များတွင် အူမကြီးကင်ဆာ ဖြစ်ပွားမှုအပေါ် သက်ရောက်မှုများ။ကြီးထွားမှုမျဉ်းကွေးများ (က)၊ အကျိတ်အရွယ်အစား (ခ)၊ ကိုယ်အလေးချိန် (ဂ)၊ နှင့် အကျိတ်ပုံများ (ဃ) တို့ကို ပြသထားသည်။အမှားဘားများသည် ±SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ n = 10. ****p < 0.0001၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t စာမေးပွဲ။ n = 10. ****p < 0.0001၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t စာမေးပွဲ။ n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента။ n = 10. ****p < 0.0001 နှစ်မြီးရှည် ကျောင်းသား၏ t-test။n = ၁၀။ ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验။ ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验။ ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента။ ****p < 0.0001 two-tailed Student's t-test.e Kaplan-Meier သည် DARS-AS1 ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုအဆင့်နှင့် UVM၊ KICH၊ KIRP၊ MESO၊ GBM နှင့် LGG ရှိသော လူနာများတွင် အလုံးစုံရှင်သန်မှုကြားဆက်စပ်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။လူနာများတွင် DARS-AS1 ၏မြင့်မားသောအဆင့်သည် 50% တွင်ရှိသည်။လူနာများတွင် DARS-AS1 ဖော်ပြမှုအဆင့်နိမ့်နိမ့် 50% တွင်ရှိသည်။p-values ​​များကို log rank test ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပါသည်။f DARS-AS1 သည် PACT-PKR လမ်းကြောင်းနှင့် အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် အဆိုပြုပုံစံ။
DARS-AS1 ၏လက်တွေ့အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာနားလည်ရန်၊ ၎င်း၏ဖော်ပြမှုနှင့် လူနာရှင်သန်မှုကြားဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့စစ်ဆေးခဲ့သည်။TCGA ဒေတာအတွဲကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့်၊ ပိုမိုမြင့်မားသော DARS-AS1 ဖော်ပြချက်သည် uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex တို့နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။အသက်ရှင်သန်မှု နိမ့်ကျမှုသည် glioblastoma morphosis (GBM) နှင့် အဆင့်နိမ့် ဦးနှောက် glioma (LGG) (ပုံ 5e) နှင့် သိသိသာသာ ဆက်စပ်နေပါသည်။ဤရလဒ်များက DARS-AS1 သည် ကုသမှုဆိုင်ရာအကျိတ်တိုးတက်မှုအတွက် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်နိုင်ပြီး ကင်ဆာအများအပြားတွင် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ကြိုတင်ခန့်မှန်းနိုင်သော biomarker တစ်ခုဖြစ်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကြီးမားသော CRISPRi လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ စစ်ဆေးမှုအား အသုံးပြု၍ DARS-AS1 lncRNA သည် အဓိကစိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်ပေးသူ နှစ်ဦးဖြစ်သည့် PACT နှင့် PKR ကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် ကင်ဆာဆဲလ်ဖိစီးမှုကို ကျော်လွှားနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။PACT နှင့် တိုက်ရိုက် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်ခြင်းဖြင့်၊ DARS-AS1 သည် PACT-mediated PKR activation ကို ဟန့်တားထားပြီး၊ ထို့ကြောင့် apoptotic ဆဲလ်သေခြင်းကို တားဆီးပေးပြီး ဆဲလ်များ ပြန့်ပွားမှုကို မြှင့်တင်ပေးခြင်း (ပုံ။ 5f)။DARS-AS1 ကို တင်းကျပ်သော အခြေအနေများအောက်တွင် ကင်ဆာဆဲလ်များ ရှင်သန်မှုကို မြှင့်တင်ပေးခြင်း၏ လုပ်ဆောင်ချက်သည် ကင်ဆာအမျိုးအစားများစွာတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် သက်ရောက်မှုရှိနိုင်ကြောင်း DARS-AS1 ၏ စည်းမျဉ်းကို ကင်ဆာအမျိုးအစားများစွာတွင် လေ့လာတွေ့ရှိထားသည်။
PACT ကို PKR activator ပရိုတင်းအဖြစ်သတ်မှတ်ထားပြီး PACT-mediated PKR activation သည် စာသားမှတ်တမ်း၊ ဘာသာပြန်ခြင်း၊ apoptosis နှင့် အခြားအရေးကြီးသောဆယ်လူလာလုပ်ငန်းစဉ်များကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် စိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုများတွင် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်ပါသည်။PACT-PKR cascade ၏ ကင်ဆာ-သတ်သတ်မှတ်မှတ် စည်းမျဉ်းကို နားလည်ရန် ဆယ်စုနှစ်များစွာ ကြိုးပမ်းခဲ့ကြသည်။ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် ဆဲလ်လူလာ lncRNA DARS-AS1 မှတဆင့် ကင်ဆာဆဲလ်များတွင် PACT-PKR ၏ စည်းမျဉ်းစည်းမျဥ်းကွဲပြားသည့် ယန္တရားတစ်ခုအား PACT နှင့် တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်ပေးကာ PACT-PKR အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကို ပိတ်ဆို့ကာ PKR activation နှင့် eIF2α phosphorylation ကို ဟန့်တားကာ စိတ်ဖိစီးမှုဖြစ်စေသော apoptosis ကို တားဆီးပေးပြီး၊ နောက်ဆုံးတွင် ကင်ဆာပြန့်ပွားမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ဆဲလ်များ။ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုသည် ကင်ဆာရောဂါကြိုတင်ခန့်မှန်းမှုနှင့် ကုထုံးအတွက် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော lncRNA ပစ်မှတ်များကို အလင်းပေးသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ DARS-AS1 ခေါက်သိမ်းခြင်းက ဆဲလ်များကို phosphorylated PKR နှင့် eIF2α သိသိသာသာတိုးလာခြင်းဖြင့် သွေးရည်ကြည်ငတ်မွတ်မှုကို အာရုံခံစေသည်။ဤရလဒ်များက DARS-AS1 သည် PACT/PKR လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်းဖြင့် ပြင်းထန်သောအခြေအနေများအောက်တွင် ကင်ဆာဆဲလ်များရှင်သန်မှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ASPACT နှင့် nc886 ကဲ့သို့သော အခြားသော coding မဟုတ်သော RNA အများအပြားသည် PACT48 mRNA ကို လျှော့ချခြင်း သို့မဟုတ် PKR49,50,64 နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် autophosphorylation ကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် PACT/PKR ဝင်ရိုးတွင် ပါ၀င်ပါသည်။၎င်းတို့အနက် DARS-AS1 သည် PACT-PKR အသင်း၏ အနှောင့်အယှက်တစ်ခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။ဤလေ့လာမှုသည် PACT/PKR ဝင်ရိုးစည်းမျဉ်းနှင့် စိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုများတွင် lncRNA ၏အခန်းကဏ္ဍကို ကျွန်ုပ်တို့၏နားလည်မှုကို ကြွယ်ဝစေသည်။
PACT တွင် သီးခြား domain သုံးခုပါရှိသည်။ပထမ dsRBD နှစ်ခုမှ တစ်ခုစီသည် PACT နှင့် PKR အကြား ဆက်စပ်မှုမြင့်မားသော ချိတ်ဆက်မှုကို ရရှိရန် လုံလောက်ပြီး၊ တတိယဒိုမိန်း (D3) သည် PKR in vitro နှင့် vivo အတွက် လိုအပ်ပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုအရ DARS-AS1 သည် D3 ဒိုမိန်းနှင့် ဦးစားပေး အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသည် (ပုံ။ 3 နာရီ)။lncRNA (768 nucleotides) ၏ ကြီးမားသော အရွယ်အစားကြောင့်၊ DARS-AS1 သည် D3 နှင့် ချိတ်ဆက်ထားခြင်းသည် dsRBD နှင့် PKR ၏ PACT ဒိုမိန်းကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို တားဆီးနိုင်ပြီး၊ ထို့ကြောင့် PACT နှင့် PKR ၏ ပေါင်းစည်းမှုကို ပိတ်ဆို့ထားသည်။D3 တွင် Ser246 နှင့် Ser287 ကို alanine သို့မဟုတ် aspartate ဖြင့် အစားထိုးသော PACT ပွိုင့် ဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် DARS-AS1 အတွက် ၎င်း၏ ဆက်စပ်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပြီး ၎င်းတို့၏ ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် လျှပ်စစ်ဂုဏ်သတ္တိများ၏ အရေးပါမှုကို ညွှန်ပြသည်။ပိုမိုတိကျသောဇီဝဓာတုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ကြည်လင်ပြတ်သားမှုမြင့်မားသော PACT ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို အသုံးပြု၍ ဤယန္တရား၏နောက်ထပ်အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို အနာဂတ်တွင် လိုအပ်မည်ဖြစ်ပါသည်။
ယခင်လေ့လာမှုများက DARS-AS1 သည် 51,52,53 ယန္တရားများစွာဖြင့် ဆဲလ်များပေါက်ပွားမှုကို အားပေးသည်ဟု ဖော်ပြခဲ့သည်။ဥပမာတစ်ခုတွင်၊ DARS-AS1 သည် ကျောက်ကပ်ကင်ဆာဆဲလ်များတွင် miP-194-5p ကို ပစ်မှတ်ထားခြင်းဖြင့် ၎င်း၏ antisense ပရိုတင်း-ကုဒ်ဝှက်ခြင်း DARS ဗီဇကို ပြုပြင်ပေးကြောင်း စူးစမ်းလေ့လာသူများက လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။သို့သော်လည်း လက်ရှိလေ့လာမှုတွင် DARS-AS1 နှောင့်နှေးခြင်းသည် အူမကြီး၊ ရင်သားနှင့် အသည်းကင်ဆာများအပါအဝင် ကင်ဆာအမျိုးအစားများစွာတွင် DARS စာသားမှတ်တမ်းအပေါ် သက်ရောက်မှုအနည်းငယ်သာ ရှိခဲ့သည်။lncRNA များသည် ဆဲလ်-နှင့် တစ်ရှူး-သတ်သတ်မှတ်မှတ် ဖော်ပြမှုပုံစံများကို ပြသသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များနှင့် မတူညီသော ကင်ဆာများ၏ ယခင်အကဲဖြတ်မှုများကြားတွင် ဤကွာခြားမှုကို အထောက်အကူဖြစ်စေနိုင်သည့် ကင်ဆာအမျိုးအစားများတစ်လျှောက် လုပ်ဆောင်မှုယန္တရားများကို ထိန်းသိမ်းထားနိုင်မည်မဟုတ်ပေ။အမျိုးမျိုးသော ဇီဝကမ္မနှင့် ရောဂါဗေဒ ဖြစ်စဉ်များ၏ တိကျသော ယန္တရားများကို ရှင်းလင်းရန် အထူးလေ့လာမှုများ လိုအပ်ပါသည်။
ကုသမှုဆိုင်ရာ အချက်အလက်များ၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အကျိတ်ရှိ DARS-AS1 ဖော်ပြမှုသည် ကင်ဆာရောဂါဖြစ်ပွားမှုတွင် DARS-AS1/PACT/PKR ဝင်ရိုး၏အရေးပါမှုကို အလေးပေးသည့် ကင်ဆာလူနာများ၏ ရှင်သန်မှုနှင့် ပြောင်းပြန်ဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုအရ DARS-AS1 သည် PACT/PKR အချက်ပြဝင်ရိုး၏ထိန်းညှိမှုတစ်ခုဖြစ်ပြီး ကင်ဆာဆဲလ်ကြီးထွားမှုကို အားပေးကာ စိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုကာလအတွင်း apoptosis ကို ဟန့်တားပေးသည်၊ ၎င်းသည် နောက်ထပ်သုတေသနလိုင်းတစ်ခုဖြစ်ပြီး အလားအလာရှိသောကုသမှုများအတွက် အနာဂတ်သုတေသနများအတွက် စိတ်ဝင်စားဖွယ်ဖြစ်သည် .
လူ့ဆဲလ်လိုင်းများ SW620၊ A549၊ MBA-MD-231၊ HCT116၊ HepG2 နှင့် HEK293T ကို တရုတ်နိုင်ငံရှိ National Cell Line Resource Infrastructure မှ ရယူခဲ့သည်။ဆဲလ်အားလုံးကို DMEM ကြားခံ (DMEM၊ Thermo Fisher Scientific၊ Waltham၊ MA) တွင် 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) နှင့် 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 37°C, 5% CO2 တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ပေါက်ဖွားသည်။
Anti-PACT၊ Abcam (ab31967);Anti-PKR၊ Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag၊ Abcam (ab125243);Anti-eIF2α၊ Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);ဆန့်ကျင် PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin၊ CST (2128);ပုံမှန် mouse IgG, CST (5415S);ပုံမှန်ယုန် IgG, CST (2729S)။Antibodies များကို အနောက်တိုင်း ပိတ်ဆို့ခြင်းအတွက် PBST တွင် 1:1000 နှင့် IP အတွက် 1:100 ကို ရောနှောထားသည်။
sgRNA များကို CRISPR-ERA66 ဟုခေါ်သော အများသူငှာရရှိနိုင်သည့်ကိရိယာကို အသုံးပြု၍ တီထွင်ခဲ့ခြင်းဖြစ်သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် sgRNA ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် မူရင်းတူးလ်ဘောင်များကို အသုံးပြုပြီး 3 kb ဒေသရှိ sgRNA ပေါင်းစပ်ထားသောဆိုဒ်များကို တွက်ချက်ထားသော အယ်လဂိုရီသမ်ကို အသုံးပြုထားပါသည်။TSS တွင်ဗဟိုပြုသည်။sgRNA oligonucleotides ၏ရေကန်များကို CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) တွင် ပေါင်းစပ်ပြီး လူသားအဖြစ်ပြုလုပ်ထားသော pgRNA plasmids (Addgene #44248) အဖြစ်သို့ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ပေါင်းစည်းထားသော လူသားဆန်သော pgRNA plasmid ၏ စုစုပေါင်း 12 µg၊ psPAX2 ၏ 7.2 µg (Addgene #12260) နှင့် pMD2.G ၏ 4.8 µg (Addgene #12259) ကို DNA Transction 106 HEK293T စင်တီမီတာတွင် အသုံးပြု၍ 5 x 106 HEK293T ပန်းကန်များထဲသို့ ပူးတွဲကူးစက်ခဲ့သည် ဆဲလ်များ (CWBIO၊ ပေကျင်း၊ တရုတ်) သည် ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များကို လိုက်နာသည်။ဗိုင်းရပ်စ်ပါရှိသော supernatant များကိုကူးစက်ပြီးနောက် 48 နှင့် 72 နာရီအကြာတွင်စုဆောင်းပြီး 0.45 µm filter ဖြင့်စစ်ထုတ်သည်။စစ်ဆေးမှုအတွက်၊ dCas9/KRAB ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကိုဖော်ပြသည့် SW620 ဆဲလ်များကို ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်မှုမှ ရယူခဲ့သည်။မွမ်းမံထားသော SW620 ဆဲလ်များသည် 0.1-0.3 ရှိသော MOI တွင် သီးခြားကူးစက်မှုစမ်းသပ်ချက်လေးခုတွင် ဗိုင်းရပ်စ်စာကြည့်တိုက်တွင် ကူးစက်ခံရပြီး 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) ဖြင့် နမူနာများကို ၂ ရက်ကြာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ယင်းနောက်၊ ဆဲလ်များကို စစ်ဆေးရန်အတွက် အနည်းဆုံး 500 ဆဲလ်/sgRNA ၏ စာကြည့်တိုက်လွှမ်းခြုံမှုဖြင့် vitro တွင် ၁၈ ရက်ကြာ မွေးမြူခဲ့သည်။
QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN၊ Düsseldorf၊ Germany; 51183) ၏ ညွှန်ကြားချက်အရ Genomic DNA ကို ထုတ်ယူခဲ့သည်။စုစုပေါင်း၊ စာကြည့်တိုက်ကိုတည်ဆောက်ရန်အတွက် ဇီဝအထပ်ထပ်တစ်ခုလျှင် genomic DNA 100 μg ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။sgRNA ဒေသကို PCR နှစ်ကြိမ်ဖြင့် ချဲ့ထွင်ပြီး ဘားကုဒ်တစ်ခုနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။
PCR ထုတ်ကုန်များအား NucleoSpin® ဂျယ်နှင့် PCR သန့်စင်ရေးကိရိယာ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ကို အသုံးပြု၍ သန့်စင်ပြီး Qubit™ HS နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA ထောက်လှမ်းမှုကိရိယာ (Thermo Fisher Scientific; Q32854) ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာသည်။
MTS assay ကို ဆဲလ်ပြန့်ပွားမှုကို တိုင်းတာရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ဆဲလ်များကို ကနဦးသိပ်သည်းဆ 2000 ဆဲလ်/ရေတွင်း 96 တွင်းတွင် မျိုးစေ့ချထားသည်။စုစုပေါင်း 4-6 ရက်အတွက် သတ်မှတ်ထားသောအချိန်၌ ဆဲလ်အရေအတွက်ကို နေ့စဉ်တိုင်းတာသည်။ရေတွင်းတစ်ခုစီအတွက်၊ MTS ဓာတ်ပစ္စည်းများ (Promega) ၏ 20 μl ကို DMEM 100 μl ဖြင့် ရောစပ်ထားပြီး 37°C တွင် 4 နာရီကြာ ဆဲလ်များဖြင့် ပေါက်ဖွားပြီး OD490 ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။
စက်လုံးများဖွဲ့စည်းခြင်းကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် မရပ်မနား တိုးတက်မှုအတွက် စွမ်းရည်ကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ shRNA DARS-AS1 သို့မဟုတ် ထိန်းချုပ်မှု shRNA ဖြင့် ကူးစက်သော ဆဲလ် 2000 ကို 4 ရက်တိုင်း အလယ်အလတ်ပြောင်းလဲမှုဖြင့် အလွန်နည်းသော ပူးတွဲပါဝါရှိသော မိုက်ခရိုပလိတ်များ (Corning) တွင် မွေးမြူထားပါသည်။spheroids ကို 14 ရက်အကြာတွင်ရေတွက်ခဲ့သည်။တိုးတက်မှု စစ်ဆေးမှုအတွက် DARS-AS1 overexpression plasmid သို့မဟုတ် control plasmid ဖြင့် ကူးစက်သော ဆဲလ် 500 ကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင် ပြုလုပ်ရန် အသုံးပြုသည်၊ သို့မဟုတ်ပါက နည်းလမ်းကို မပြောင်းလဲပါ။
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) ၏ ညွှန်ကြားချက်အရ RNA ကို T7 RNA polymerase နှင့် biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ဖြင့် ကူးယူဖော်ပြပါသည်။ဤနေရာတွင်အသုံးပြုသော primers များကို နောက်ဆက်တွဲဇယား 4 တွင်ဖော်ပြထားပါသည်။
ပရိုတင်း-ကုဒ်ရေးနည်း PACT သို့မဟုတ် PKR နယ်မြေများကို pET15b (Addgene #73619) အဖြစ် ပုံတူပွားပြီး BL21(DE3) အဖြစ် ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ဘက်တီးရီးယားများကို ampicillin ဖြင့် ပံ့ပိုးပေးသော LB တွင် တစ်ညလုံးပေါက်ဖွားပြီး 100-ဆ လတ်ဆတ်သော LB ဖြင့် ရောနှောထားသည်။အလတ်စား၏ OD600 သည် 0.8 သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ 1 mM IPTG သည် ပရိုတိန်းဖော်ပြမှုကို လှုံ့ဆော်ရန်အတွက် ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။ညင်သာစွာလှုပ်ယမ်းခြင်း (20°C တွင် 250 rpm) ဖြင့် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် ဆဲလ်အမှုန်များကို centrifugation (4000 rpm၊ 10 min၊ 4°C) ဖြင့် စုဆောင်းခဲ့သည်။ဆဲလ်အမှုန်အမွှားအား lysis ကြားခံတွင် (50 mM Tris၊ pH 8.0၊ 250 mM NaCl၊ 1 mM PMSF) နှင့် ရေခဲပေါ်တွင် မိနစ် 30 ကြာ သားဖောက်ပြီးနောက် sonicate (15 မိနစ်၊ 5 စက္ကန့်၊ ရေခဲပေါ်/ဖွင့်) နှင့် centrifuge (13,000) rpm)။30 မိနစ်၊ 4°C)။ထို့နောက် supernatant အား Ni-NTA resin (QIAGEN) တွင် အပူချိန် 4°C တွင် ၃ ကြိမ် တင်ကာ wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) နှင့် စုစုပေါင်း 3 ကြိမ် နှုတ်ယူခဲ့သည်။ 10 ml ၏ထူးခြားသောကြားခံ (50 mM Tris၊ pH 8.0၊ 250 mM NaCl၊ 300 mM imidazole)။သန့်စင်ထားသော ပရိုတင်းကို WB သုံးပြီး ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုအား Qubit™ ပရိုတင်းစစ်ဆေးမှုကိရိယာ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ကို အသုံးပြု၍ အာရုံစူးစိုက်မှုအား ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း RIP စစ်ဆေးမှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ 1x RIP ကြားခံ (25 mM Tris-HCl၊ pH 7.5၊ 100 mM NaCl၊ 0.5% NP-40၊ RNasin ribonuclease inhibitor (Promega)၊ PMSF (Beyotime Biotechnology)၊ 1 mM DDM၊ protease) lyses 7 x 10 ကော့တေး (Roche၊ 1 mM DTT) နှင့် 13,000 rpm တွင် 4°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ centrifuge ။ထို့နောက် supernatant ကို ပရိုတင်း A+G သံလိုက်ပုတီးစေ့ (Millipore) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော PACT ပဋိပစ္စည်း (Abeam) သို့မဟုတ် IgG (CST) 5 μg ဖြင့် ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။ပုတီးစေ့များကို 5x RIP ကြားခံဖြင့် 5 ကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက် ပရိုတင်းဓာတ် K (NEB) ဖြင့် ချေဖျက်သည်။RNA ကို Trizol ဖြင့် ထုတ်ယူပြီး RT-qPCR မှ ဆုံးဖြတ်သည်။Primers များကို နောက်ဆက်တွဲဇယား 5 တွင်ဖော်ပြထားသည်။
in vitro RIP assay ကို ပြုပြင်ထားသော standard RIP assay protocol တစ်ခုအရ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။in vitro transcribed RNA ၏ စုစုပေါင်း 5 pmol ကို 1x RIP ကြားခံဖြင့် ရောနှောပြီး 65°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် နှိမ့်ချပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်သို့ နှေးကွေးစွာ အအေးခံသည်။နဂိုအတိုင်း သို့မဟုတ် ပြောင်းလဲထားသော အလံ-တံဆိပ်တပ်ထားသော PACT ပရိုတင်း စုစုပေါင်း 5 pmol ကို E. coli မှ သန့်စင်ထားသည်။4°C တွင် 2 နာရီကြာ ပြန်လည်ပြုပြင်ထားသော RNA ဖြင့် သားဖောက်ပြီး အလံဆန့်ကျင်ရေး IP အတွက် RIP ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အထက်ပါလုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို လိုက်နာပါ။
RNA တိုးချဲ့မှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ 1x107 ဆဲလ်များကို 1xRIP ကြားခံဖြင့် lysed လုပ်ထားသည်။13,000 rpm တွင် 15 မိနစ်ကြာ 4°C တွင် centrifugation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ supernatant ကို 30 μl of streptavidin သံလိုက်ပုတီးစေ့ (Beckman) နှင့် 4°C တွင် 2 နာရီကြာ ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသည်။ထို့နောက် သန့်စင်ထားသော lysate ကို တဆေး tRNA ဖြင့် ဖြည့်သွင်းပြီး 4°C တွင် တစ်ညတွင်း ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ထားသော RNA ၏ 40 pmol ဖြင့် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် နောက်ထပ် 2 နာရီကြာ နှင့် BSA ဖြင့် ပိတ်ဆို့ထားသော သံလိုက်ပုတီးစေ့အသစ် 20 μl ကို ထပ်ထည့်ခဲ့သည်။ဆေးကြောခြင်းအဆင့်တွင် 5x RIP ကြားခံဖြင့် 4 ကြိမ်နှင့် 1x RIP ကြားခံဖြင့် 4 ကြိမ်ပါဝင်သည်။သက်ဆိုင်ရာပရိုတိန်းများကို biotin elution ကြားခံ (25 mM Tris-HCl၊ pH 7.5၊ 12.5 mM D-biotin၊ PMSF) နှင့် NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ဖြင့် ခွဲခြားထားသည်။ငွေရောင်ခြယ်ခြင်း (Beyotime Biotechnology) ပြီးနောက် အချို့သော တီးဝိုင်းများကို MS မှ excise လုပ်ပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။
PACT နှင့် PKR အကြား အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကို စမ်းသပ်ရန်အတွက် Co-IP ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ 1 x RIP ကြားခံတွင် 1 x 107 lysed ဆဲလ်များကို 1 x 107 lysed ဆဲလ်များ ပေါက်ဖွားပြီး 13,000 rpm တွင် 13,000 rpm တွင် 15 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားပါသည်။Lysates သည် ပရိုတင်း A + G သံလိုက်ပုတီးစေ့များဖြင့် ပြည့်နေပြီး၊ ဆန့်ကျင်ဘက် PACT ပဋိပစ္စည်း 5 µg ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားပြီး 4°C တွင် ညတွင်းချင်း ညင်သာစွာ လှည့်ပတ်ထားသည်။ပုတီးစေ့များကို 5×RIP ကြားခံဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောပြီး 1×RIP ကြားခံဖြင့် နှစ်ကြိမ်လျှော်ပြီး 1×SDS ကြားခံဖြင့် ဖယ်ထုတ်ထားသည်။ပြန်လည်ရယူထားသော ပရိုတင်းကို SDS-PAGE ဂျယ်ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး WB မှ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။
အလံပြထားသော PACT ၏ pmol နှစ်ခုနှင့် PKR ၏ 1 pmol ကို E. coli မှ သန့်စင်ခဲ့သည်။1× RIP ကြားခံတွင် အရောကို ရောပြီး 4°C တွင် 10 pmol ဖြင့် ပြုပြင်ထားသော RNA ဖြင့် သားဖောက်ပါ။ထို့နောက် ၎င်းတို့ကို ပရိုတိန်း A+G သံလိုက်ပုတီးစေ့များဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော တံဆိပ်တပ်ထားသော ပဋိပစ္စည်းဖြင့် နောက်ထပ် နှစ်နာရီကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။ထို့နောက် ပုတီးစေ့များကို 1x RIP ကြားခံဖြင့် လေးကြိမ်ဆေးကြောပြီး 1x SDS ကြားခံဖြင့် ဖယ်ထုတ်သည်။ရလဒ် PACT နှင့် PKR ကို WB မှရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။